|
中国药典2005版收载品种：重组人促红素注射液（CHO细胞）
名称:
重组人促红素注射液（CHO细胞）
汉语拼音:
Chongzu Ren Cuhongsu Zhusheye（CHO Xibao）
英文名:
Recombinant Human Erythropoietin Injection（CHO Cell）
药物组成:
本品系由含有高效表达人红细胞生成素（简称人促红素）基因的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
中西药分类:
生物制品（治疗类）
生物制品制备:
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2制造
2.1工程细胞
2.1.1名称及来源
重组人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr-（二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞）细胞系。
2.1.2细胞库建立、传代及保存
由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。每次传代不超过经批准的代次。细胞系冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。
2.1.3主细胞库及工作细胞库细胞的检定
应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
2.1.3.1外源因子检查
细菌和真菌（附录Ⅻ A）、支原体（附录Ⅻ B）、病毒检查（附录Ⅻ C）均应为阴性。
2.1.3.2细胞鉴别试验
应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。
2.1.3.3人促红素表达量
应不低于原始细胞库细胞表达量。
2.2原液
2.2.1细胞的复苏与扩增
从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能小牛血清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。小牛血清的质量应符合规定（附录Ⅻ D）。
2.2.2细胞培养液
生产用细胞培养液应不含牛血清和任何抗生素。
2.2.3细胞培养
细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。
2.2.4分离纯化
收集的培养液按经批准的纯化工艺进行，采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的重组人促红素，即为人促红素原液，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。
2.2.5原液检定
按3.1项进行。
2.3半成品
2.3.1配制与除菌
原液加入适宜稳定剂，并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。
2.3.2半成品检定
按3.2项进行。
2.4成品
2.4.1分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.4.3规格
应为经批准的规格。
2.4.4包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3检定
3.1原液检定
3.1.1蛋白质含量
依法测定（附录Ⅵ B第二法）。
3.1.2生物学活性
3.1.2.1体内法
依法测定（附录Ⅹ B）。
3.1.2.2体外法
按酶联免疫法试剂盒说明书测定。
3.1.3比活性
每1mg蛋白质应不低于1.2×105IU。
3.1.4纯度
3.1.4.1电泳法
依法测定（附录Ⅳ C）。用非还原SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%.加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。
3.1.4.2高效液相色谱法
依法测定（附录Ⅲ B）。余水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm，粒度10μm，直径7.5mm.长30cm；流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3；上样量20-100μg，于波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。
3.1.5分子量
依法测定（附录Ⅳ C）。用还原型SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36-45kD。
3.1.6紫外光谱扫描
依法测定（附录Ⅱ A），其最大吸收峰279nm±2m；最小吸收峰250nm±2nm；在320-360nm处无吸收峰。
3.1.7等电点
依法测定（附录Ⅳ D），使用PH值为3.0-5.0的两性电解质，等电点应为pH3.3-4.3。
3.1.8唾液酸含量
每1mol人促红素应不低于9.0mol（附录Ⅵ C）。
3.1.9外源性DNA残留量
每1000IU人促红素应不高于100pg（附录Ⅸ B）。
3.1.10 CHO细胞蛋白残留量
用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于0.10%。
3.1.11细菌内毒素检查
每10 000IU人促红素应小于2EU（附录Ⅻ E凝胶限量试验）。
3.1.12牛血清白蛋白残留量
用酶联免疫检测，应不高于0.01%。
3.1.13肽图（至少每半年测定1次）
供试品经透析、冻干后，用1%碳酸氢按溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定（附录Ⅷ E），其中加人胰蛋白酶（序列分析纯），37℃±0.5℃保温6小时，色谱柱为反相C8柱（25cm×46mm，粒度5μm，孔径30nm），柱温为45℃±0.5℃；流速为0.75ml/分钟；进样量为20μl；按下表进行梯度洗脱（表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液）。
编号 时间/分钟 流速/ml A% B%
1 0.00 0.75 100.0 0.0
2 30.00 0.75 85.0 15.0
3 75.00 0.75 65.0 35.0
4 115.OO 0.75 15.O 85.0
5 12O.00 0.75 0.0 100.0
6 125.00 0.75 100.0 0.0
7 145.00 0.75 100.0 0.0
肽图应与人促红素对照品一致。
3.1.14 N-末端氨基酸序列（至少每年测定1次）
用氨基酸序列分析仪测定。N-末端序列应为:
Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg－Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。
3.2半成品检定
3.2.1细菌内毒素检查
每1000IU人促红素应小于2EU（附录Ⅻ E凝胶限量试验）。
3.2.2无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
3.3成品检定
3.3.1鉴别试验
技免疫印迹法（附录Ⅷ A）或免疫斑点法（附录ⅧB）测定，应为阳性。
3.3.2物理检查
3.3.2.1外观
应为无色澄明液体。
3.3.2.2可见异物
依法检查（附录Ⅴ B），应符合规定。
3.3.2.3装量
按附录Ⅰ A中装量项进行，应不低于标示量。
3.3.3化学检定
3.3.3.1 pH值
应为6.4-7.4或5.4-6.4（附录Ⅴ A）。
3.3.3.2钠离子含量
应不大于190mmol/L（附录Ⅶ J）。
3.3.3.3枸橼酸离子含量
应不大于25mmol/L（附录Ⅶ H第二法）。
3.3.3.4蛋白质含量
依法测定（附录Ⅵ B第二法），应符合经批准的蛋白质含量范围。
3.3.4生物学活性
3.3.4.1体外法
按酶联免疫法试剂盒说明书测定供试品体外活性（IU/ml），根据标示装量计算供试品生物学活性（IU/瓶），应为标示量的80%-120%。
3.3.4.2体内法
按附录Ⅹ B测定供试品体内活性（IU/ml），根据标示装量计算供试品生物学活性（IU/瓶），应为标示量的80%-140%。
3.3.5无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
3.3.6细菌内毒素检查
每1000IU人促红素应小于2EU（附录Ⅻ E凝胶限量试验）。
3.3.7异常毒性检查
依法检查（附录Ⅻ F小鼠试验法），应符合规定。
4保存、运输及有效期
于2-8℃避光保存和运输。自分装之日起，按批准的有效期执行。
5使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定。
|