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中国药典2005版收载品种：乙型脑炎灭活疫苗
名称:
乙型脑炎灭活疫苗
汉语拼音:
YiXing Naoyan Mihuoyimiao
英文名:
Japanese Encephalitis Vaccine，Inactivated
药物组成:
本品系用乙型脑炎（简称乙脑）病毒接种原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液、灭活病毒后制成。
用途:
用于预防乙型脑炎。
中西药分类:
生物制品（预防类）
生物制品制备:
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2制造
2.1生产用细胞
生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。
2.1.1细胞管理及检定
应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
2.1.2细胞制备
选用2周龄左右地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞是液，分装培养瓶，于37℃培养。
2.2毒种
2.2.1名称及来源
生产用毒种为乙脑病毒P3株。
2.2.2种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
脑内接种小鼠或乳鼠制备主种子批和工作种子批。原始种子批传代应不超过第53代，主种子批应不超过第68代，工作种子批应不超过第69代。
2.2.3种子批毒种的检定
主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.4项检定。
2.2.3.1互鉴别试验
毒种与相应的特异性血清等量混合，置37℃水浴90分钟，进行小鼠脑内中和试验，检定病毒的特异性，中和指数应大于500。
2.2.3.2病毒滴定
用体重为7-9g小鼠进行脑内滴定，滴度应不低于9.0lg LD50/ml。
2.2.3.3无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
2.2.3.4支原体检查
依法检查（附录Ⅻ B），应符合规定。
2.2.3.5病毒外源因子检查
依法检查（附录Ⅻ C），应符合规定。
2.2.3.6免疫原性检查
用主种子批毒种制备原疫苗，腹腔免疫体重为12-14/小鼠10只，每只0.3ml，免疫2次，间隔3天，于初免第10-14天，用不低于10 000LD50病毒量的非生产用乙脑病毒P3株进行腹腔攻击，同时每只脑胶注射0.03ml稀释液。对照组死亡率应不低于80%，免疫组应100%保护。
2.2.4毒种保存
毒种应置-60℃以下保存；液体工作种子批于-60℃保存时间应不超过1年。
2.3原液
2.3.1细胞制备
同2.1.2项。
2.3.2培养液
培养液为含适量灭能小牛血清和乳蛋白水解物的Earle’s液或其他适宜培养液。用于细胞培养的小牛血清应为乙脑抗体阴性。小牛血清的质量应符合要求（附录Ⅻ D）。
2.3.3对照细胞病毒外源困于检查
依法检查（附录Ⅻ C），应符合规定。
2.3.4病毒接种和培养
挑选生长致密单层细胞，弃去培养液，用PBS充分冲洗细胞，去除小牛血清后，加适量维持液，接种病毒，在适宜温度下培养。
2.3.5病毒收获
选择有典型细胞病变的培养物，澄清过滤至大容器中，使其成均一病毒液，再经过澄清膜过滤或连续流离心。可根据细胞情况，换加维持液继续培养，多次收获病毒液，收获物即为病毒收获液。
2.3.6病毒收获液检定
按3.1项进行。
2.3.7病毒灭活
按1.2000的比例加入甲醛溶液，置适宜温度下一定时间灭活病毒，即为原液。可加人硫柳汞，终浓度应不高于0.10mg/ml。
2.3.8原液检定
按3.2项进行。
2.4半成品
2.4.1配制
无菌检查合格的原液合并后即为半成品。
2.4.2半成品检定
按3.3项进行。
2.5成品
2.5.1分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.5.2分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.5.3规格
每瓶 2.0ml、5.0ml、10ml。每1次人用剂量为0.5ml。
2.5.4包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3检定
3.1病毒收获液检定
3.1.1病毒滴定
自不超过150L。病毒收获液中取样进行病毒滴定。将病毒收获液10倍系列稀释，取至少3个稀释度，每个稀释度脑内接种体重为7-9g小鼠4只，每只0.03ml，逐日观察，3日内死亡者不计，观察14天，滴度应不低于7.5lg LD/ml。
3.1.2无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
3.1.3支原体检查
依法检查（附录Ⅻ B），应符合规定。
3.2原液检定
3.2.1无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
3.2.2病毒灭活验证试验
自不超过150L原液中取样进行病毒灭活验证试验。取原液脑内接种体重为12-14g 小鼠8只，每只,0.03ml，同时腹腔接种0.5ml，为第1代；7天后将第1代小鼠处死3只，取脑制成10%悬液，脑内接种6只小鼠，为第2代；7天后将第2代小鼠处死3只，同法接种6只小鼠，为第3代。从接种之日起逐日观察14天。每代小鼠除处死和接种后3日内非特异性死亡外，全部健存为合格。
若传代3日后有个别小鼠死亡，应立即取鼠脑制成悬液再接种3只小鼠，观察14天，小鼠均健存仍判合格。如仍有小鼠死亡，则应复试，复试合格后仍可使用。复试后仍有小鼠死亡该批原液应予废弃。
3.3半成品检定
无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
3.4成品检定
3.4.1鉴别试验
按3.4.4项进行，应符合规定。效价测定不合格，鉴别试验不成立。
3.4.2外观
应为橘红色澄明液体，无异物，无沉淀。
3.4.3化学检定
3.4.3.1 pH值
应为7.2-8.0（附录Ⅴ A）。
3.4.3.2游离甲醛含量
应不高于0.50mg/ml（附录Ⅵ L）。
3.4.3.3硫柳汞含量
应不高于0.10mg/ml（附录Ⅶ B）。
3.4.4效价测定
采用免疫小鼠中和抗体测定法。每批效价测定用本品代表的原液量不得超过1000L。以蚀斑减少中和试验测定中和抗体。参考疫苗（RA和RB）及中和试验阳性血清由国家药品检定机构提供。
将被检疫苗（T）和参考疫苗（R）分别稀释成1:32，腹腔免疫体重为12-14g-14g 小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天。第2次免疫后第7天采血，分离血清，同组血清等量混合，于56℃灭活30分钟。稀释阳性血清、被检疫苗血清和参考疫苗血清，分别与稀释病毒（约200PFU/0.4ml）等量混合，同时将稀释后的病毒与正常小鼠血清等量混合，作为病毒对照，置37℃水浴90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，置37℃培养90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于37℃5%二氧化碳孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算被检疫苗和参考疫苗组对病毒对照组的烛斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50-150之间。
判定标准如下:
(1)合格:T≥（RA＋RB）/2－0.33
(2）重试:（RA＋RB）/2－0.66＜T＜（RA＋RB）/2－0。33
(3）不合格:T＜（RA＋RB）/2-0.66
3.4.5热稳定性试验
疫苗出厂前应进行热稳定性试验。于37℃放置7天，按3.4.4项进行效价测定。如合格，视为效价测定合格。
3.4.6牛血清白蛋白残留量
采用酶联免疫法，牛血清白蛋白残留量应不高于50ng/剂。
3.4.7无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
3.4.8异常毒性检查
依法检查（附录Ⅻ F），应符合规定。
3.4.9细菌内毒素检查
应不高于100EU/剂（附录Ⅻ E凝胶限量试验）。
3.5亚硫酸氢钠溶液检定
3.5.1亚硫酸氢钠含量
浓度应为15%-25%（附录Ⅶ E）。
3.5.2无毒性验证试验
按使用浓度稀释本品，腹腔注射体重为18-20g小鼠5只，每只0.5ml，观察7天，应全部健存。
4保存、运输及有效用
于2-8℃避光保存和运输。自效价测定合格之日起，有效期为2年。
5使用说明
乙型脑炎灭活疫苗使用说明。
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