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中国药典2005版收载品种：乙型脑炎减毒活疫苗
名称:
乙型脑炎减毒活疫苗
汉语拼音:
YiXing Naoyan Jiandu Huoyimiao
英文名:
Japanese Encephalitis Vaccine，Live
药物组成:
本品系用乙型脑炎（简称乙脑）减毒株病毒接种于历代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液，加入适宜稳定剂后冻干制成。
用途:
用于预防乙型脑炎。
中西药分类:
生物制品（预防类）
生物制品制备:
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2制造
2.1生产用细胞
生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5计的地鼠’仔细胞。
2.1.1细胞管理及检定
应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定须程”规定。
2.1.2细胞制备
选用10-14日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，置37℃士1℃培养。细胞生长成致密单层后接和病毒。
2.2毒种
2.2.1名称及来源
生产用毒种为乙脑病毒SA14-14-2 减毒株。
2.2.2种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
原始种子批传代应不超过第6代，主种子批应不超过第8代，工作种子批应不超过第9代，生产的疫苗应不超过第10代。
2.2.3种子批毒种的检定
主种子批应进行以下全面检定。工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.4项检定。
2.2.3.1鉴别试验
毒种批与非同源性乙脑特异性抗体混合，置37℃水浴90分钟，接种地鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察5-7天判定结果。中和指数应大于1000。
2.2.3.2病毒滴定
取毒种做10倍系列稀释，至少取3个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定。冻干种子批病毒滴度应不低于5.7lg PFU/ml；液体种子批病毒滴度应不低于7.2lg PFU/ml。
2.2.3.3无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
2.2.3.4支原体检查
依法检查（附录Ⅻ B），应符合规定。
2.2.3.5病毒外源因子检查
依法检查（附录Ⅻ C），应符合规定。
2.2.3.6E蛋白基因稳定性试验
以E蛋白基因区核音酸序列测定验证其遗传稳定性编码E蛋白基因区的8个关键位点氨基酸不能发生改5（E-107:苯丙氨酸，E-138:赖氨酸，E-176:缬氨酸K-177:丙氨酸，E-264:组氨酸，E-1279:蛋氨酸E-315:缬氨酸，E-439:精氨酸）。
与基因库中登录号为D90195的乙型脑炎减毒株SA14-14-2株的E蛋白基因区核着酸序列的同源性不低于99.6%。
2.2.3.7免疫原性检查
用主种子批毒种制备原疫苗，取10－3、10－4、10-至少3个稀释度，分别免疫体重为10-12g小鼠10只每只皮下注射0.1ml，免疫1次。免疫后14天用P3株乙脑强毒腹腔攻击，每只注射0.3ml，其病毒量应不低于500腹腔滴定的LD50。同时每只小鼠脑内接种稀释液0.03ml。攻击后14天判定结果，ED50应不高于3.0lg PFU，攻击对照组小鼠死亡率应不低于80%。
2.2.3.8猴体神经毒力试验
用病毒滴度不低于5.7lg PFU/ml的冻干主种子批进行猴体神经毒力试验。将主种子批毒种作1:5稀释，大分别注射10只恒河猴的两侧丘脑各0.5ml和腰部脊髓内0.2ml。对照组用强毒SA14。株稀释成102 PFU/ml和10 PFU/ml病毒量，以同法接种恒河猴，每个稀释度注射。只恒河猴。
对SA14－14－2减毒组的10/只恒河猴观察至少18天.应无任何临床症状，组织学检查仅表现为注射部位、脑和脊髓有轻微的炎症反应。而对照组SA14株在注射后8天内病毒量103 PFU/ml组4只恒河猴应全部死亡；病毒量为102PFU/ml组的4只恒河猴，至少应有2只死亡。组织学检查表现主要特征为神经细胞坏死，较少炎症反应。
2.2.3.9脑内致病力试验
用种子批毒种接种体重为12-14g小鼠，至少10只，每只脑内注射0.03ml，观察14天应存活。接种后3天内死亡者不计，但3天内死亡数不得超过20%。3无后如有小鼠发病，应处死后取脑，测定致病力。小鼠脑内毒力应不高于3.0lg LD50/0.03ml，同时以10-1病鼠脑是液皮下注射体重为10-12g小鼠10只，每只0.1ml，观察14天，应全部健存。
2.2.3.10皮下感染人脑试验
用种子批毒种接种体重为10-12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天，应全部健存。
2.2.3.11乳鼠传代码返相试验
用病毒滴度不低于7.2lg PFU/ml（液体毒种）或不低于5.7lg PFU/ml（冻干毒种）的种子批毒种接种3-5日龄乳鼠10只，每只脑内注射0.02ml。将发病的乳鼠处死3只，解剖取脑，用体重为12-14g小鼠测其致病力，脑内毒力应不高于3.0lg LD50/0.03ml，同时以10-1的发病乳鼠脑悬液皮下注射体重为10-12g小鼠10只，每只0.1ml，观察14天，应全部健存。
2.2.4毒种保存
应置-60℃以下保存。
2.3原液
2.3.1细胞制备
同2.1.2项。
2.3.2培养液
培养液为含适量灭能小牛血清和乳蛋白水解物的sarfe’s液或其他适宜培养液。用于细胞培养的小牛血清应为乙脑抗体阴性。小牛血清的质量应符合要求（附录Ⅻ D）。
2.3.3对照细胞病毒外源因子检查
依法检查（附录Ⅻ C），应符合规定。
2.3.4病毒接种和培养
挑选生长致密单层的细胞，用洗涤液充分冲洗后加适量维持液，按0.001MOI（或维持液内的病毒滴度为2.7-3.7lg PFU/ml）接种病毒，置36℃士1℃培养。
2.3.5病毒收获
种毒后72小时左右细胞出现病变时收获病毒液。可根据细胞情况，换加维持液继续培养，多次收获病毒液。
2.3.6单次病毒收获液合并
合并多次病毒收获液，澄清过滤，即为原液。
2.3.7原液检定
按3.1项进行。
2.4半成品
2.4.1配制
检定合格的原液加适量稳定剂即为半成品，每批量不得超过150L。
2.4.2半成品检定
按3.2项进行。
2.5成品
2.5.1分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.5.2分装及冻干
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。分装过程中疫苗半成品应置冰浴中。
2.5.3 规格
按标示量复溶后每瓶0.5ml、2.5ml。每1次人用刑量为0.5ml，含乙型脑炎活病毒应不低于5.4lg PFU
2.5.4包装
应符合“牛物制品包装规程”规定。
3检定
3.1原液检定
3.1.1病毒滴定
按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于7.0lg PFU/ml。
3.1.2无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
3.1.3支原体检查
依法检查（附录Ⅻ B），应符合规定。
3.1.4逆转录酶活性检查
依法检查（附录Ⅺ M），应为阴性。
3.2半成品检定
3.2.1病毒液定
按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于6.8lg PFU/ml 。
3.2.2菌检查
依法检查（附录ⅫA），应符合规定。
3.3成品检定
除水分测定外，按标示量加入灭菌PBS，复溶后进行以下各项检定。
3.3.1鉴别试验
按2.2.3.1项进行。
3.3.2外观
应为淡黄色疏松体，复溶后为橘红色或淡粉红色澄明液体，无异物。
3.3.3水分
应不高于3.0%（附录Ⅶ D）。
3.3.4病毒滴定
按2.2.3.3项进行，病毒滴度应不低于巴5.7lg PFU/ml。
3.3.5热稳定性试验
疫苗出肝前应进行热稳定性试验，应与病毒滴定同时进行。于37℃放置7天，按2.2.3.2项进行，病毒液度应不低于5.7lg PFU／ml，病毒滴度下降应不高于1.0lh PFU/ml
3.3.3牛血清白蛋白残留量
采用酶联免疫法，牛血清白蛋白残留量应不高于50ng/剂。
3.3.7安全试验
3.3.7.1脑内致病力试验
同2.2.3.9项。
3.3.7.2乳鼠传代返祖试验
同2.2.3.11项。
3.3.8无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
3.3.9异常毒性检查
依法检查（附录Ⅻ F），应符合规定。
3.4疫苗稀释剂检定
疫苗稀释剂为灭菌PBS。
3.4.1 pH值
应为7.2-8.0（附录Ⅴ A）。
3.4.2无菌检查
依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。
4保存、运输及有效用
于8℃以下避光保存和运输。自病毒滴度检定合格之日起，有效期为1年6个月。
5使用说明
乙型脑炎减毒活疫苗使用说明
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